乙酰膽堿受體抗體檢測界值的優(yōu)化及對(duì)重癥肌無力診斷效能的驗(yàn)證
Optimization of the cut-offs in acetylcholine receptor antibodies and diagnostic performance in myasthenia gravis patients
李海峰，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；
邵凱，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院（青島）醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；
郝洪軍，北京大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)免疫實(shí)驗(yàn)室
乙酰膽堿受體抗體（AChRAb）是重癥肌無力（MG）的主要致病性抗體，在MG的診斷、亞組分類和療效監(jiān)測中具有重要意義。
結(jié)合型AChRAb是最常檢測的抗體，目前常用方法有定量的酶聯(lián)免疫（ELISA）法和放射免疫沉淀（RIA）法以及半定量的細(xì)胞免疫熒光（CBA）法。無論商品化試劑盒還是實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的in-house試劑盒，驗(yàn)證其臨床診斷效能既是檢驗(yàn)醫(yī)生的課題，更是臨床醫(yī)生的課題。
在試劑盒開發(fā)過程中，往往采用從患者和對(duì)照取得的樣本，明確其敏感性、特異性等檢驗(yàn)準(zhǔn)確性的內(nèi)在指標(biāo)。定量檢測界值的設(shè)定對(duì)結(jié)果判斷分析的影響不應(yīng)忽視，應(yīng)該充分考慮診斷的實(shí)際需要以及漏診和誤診帶來的問題。
抗體陰性情況下，亦可通過新斯的明試驗(yàn)和電生理診斷MG，但對(duì)不典型患者若僅有抗體陽性作為支持證據(jù)，則有可能誤診為MG而施以長期免疫治療，因此設(shè)定界值時(shí)需考慮在盡可能不減少敏感性的同時(shí)特異性適度優(yōu)先。MG合并其他自身免疫疾病較常見，自身免疫疾病導(dǎo)致的非特異性結(jié)合有可能使抗體測量值略有升高，與MG鑒別診斷的疾病中也常有自身免疫疾病。對(duì)照組的設(shè)置會(huì)影響界值的設(shè)定，納入適合的正常對(duì)照人群和其他自身免疫疾病對(duì)照人群至關(guān)重要。
通常I期診斷試驗(yàn)僅有患者樣本而無患者的具體信息，而MG是異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病，其診斷效能需要在具有不同臨床特征的患者中驗(yàn)證。II期診斷試驗(yàn)納入疾病臨床譜系中不同特征者，有助于驗(yàn)證真實(shí)世界的診斷效能；同時(shí)因納入健康人對(duì)照和疾病對(duì)照，在界值優(yōu)化過程中也充分考慮到鑒別診斷的疾病。因此，II期診斷試驗(yàn)有助于同時(shí)解決上述兩個(gè)問題，建立合理的檢測界值并模擬真實(shí)世界人群驗(yàn)證其診斷效能。
檢測結(jié)果有多種表達(dá)方法：ELISA法可表達(dá)為原始值（OD值）和轉(zhuǎn)化值（抑制率、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化而來的濃度[曲線濃度]、根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式轉(zhuǎn)化而來的濃度[經(jīng)驗(yàn)濃度]），RIA法表達(dá)為原始值（cpm值）和轉(zhuǎn)化值（結(jié)合率、經(jīng)驗(yàn)濃度）。
檢測界值設(shè)定可使用定性方法，其建立方法包括：
1、P/N比，為（待測樣本OD值-空白對(duì)照OD值）/（陰性樣本OD值-空白對(duì)照OD值），一般以P/N ≥ 2.1為陽性；
2、S/CO比，S是待測樣本OD值，CO為界值（cut-off），通常取值陰性對(duì)照平均值的2.1倍，間接法S/CO比 ≥1為陽性，競爭法S/CO比 ≤1為陽性。
目前更多使用定量方法設(shè)定界值，包括：
1、主觀法，包括1）符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)集直接使用mean ± 3SD，2）不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)集使用百分位數(shù)法或轉(zhuǎn)換法（轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布后計(jì)算mean ± 3SD再轉(zhuǎn)換回去形成界值），3）無論是否為正態(tài)分布均使用健康對(duì)照（HC）和其他自身免疫疾病對(duì)照（OAD）的最高值（粗暴法）；
2、ROC法，通過最大Youden指數(shù)獲得。
研究設(shè)計(jì)和結(jié)果
1. 患者和對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)
從同期500例MG患者中通過匹配性別、年齡、病程、采集樣本時(shí)受累（眼肌型、全身型、緩解）、最嚴(yán)重時(shí)受累（眼肌型、全身型）、伴胸腺瘤者占比以及采集樣本時(shí)和最嚴(yán)重時(shí)的QMGs評(píng)分等關(guān)鍵臨床特征，選取77例與真實(shí)世界人群臨床特征分布相近的代表性MG患者構(gòu)成研究隊(duì)列。
MG符合下列診斷標(biāo)準(zhǔn)：疲勞試驗(yàn)陽性、新斯的明試驗(yàn)陽性和RNS低頻遞減，診斷由兩名MG專家共識(shí)取得。
患者的臨床特征見表1，具有與真實(shí)世界隊(duì)列相似的代表性分布。
表1 納入MG患者的臨床特征
80例健康查體者作為HC，中位年齡37歲，IQR為19歲（20-68歲）。
80例其他自身免疫性疾?。?/span>OAD）患者，中位年齡47.5歲，IQR為19.75歲（25-81歲），包括視神經(jīng)脊髓炎譜系疾?。?/span>n = 18）、多發(fā)性硬化（n = 11）、Guilian-Barre綜合征（n = 8）、 CIDP（n = 4）、橋本甲狀腺炎（n = 9）、Graves病（n = 1）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（n = 13）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（n = 10）、銀屑病關(guān)節(jié)炎（n = 2）、系統(tǒng)性硬化癥（n = 1）、系統(tǒng)性血管炎（n = 1）、強(qiáng)直性脊柱炎（n = 1）和過敏性紫癜性腎炎（n = 1）。
以上包括神經(jīng)免疫疾病和系統(tǒng)性自身免疫疾病。MG患者和對(duì)照均排除合并慢性感染性疾病者。
2. 檢測方法和結(jié)果數(shù)據(jù)
使用商品化競爭性抑制ELISA試劑盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）。在AChRAb存在下，MAb1-AChR-MAb2-/MAb3復(fù)合物的形成受到抑制，使OD值下降；血清中AChRAb濃度越高，OD值越低。抑制率計(jì)算為：100 ×（1-檢測樣本OD/陰性對(duì)照OD），經(jīng)驗(yàn)濃度計(jì)算公式為：0.2 × 2(0.067×抑制率)。使用商品化RIA試劑盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）。沉淀物的放射性與AChRAb結(jié)合的放射標(biāo)記AChR的量成正比。AChRAb濃度計(jì)算公式為：（檢測樣本cpm-陰性對(duì)照cpm）× A/（C × K × B × 2.22），其中A為碘125自生產(chǎn)日期到檢測日期時(shí)的衰減因數(shù)，B為計(jì)數(shù)器效率，C為檢測中使用血清量（μL），K為用于標(biāo)記AChR時(shí)碘125標(biāo)記毒素的活度（Ci/mmol）；A、C、K值將隨各個(gè)批次試劑盒提供。采用Levey-Jennings質(zhì)控圖對(duì)每批次檢測的原始值進(jìn)行質(zhì)控，陽性對(duì)照在mean±2SD范圍內(nèi)認(rèn)為批次檢驗(yàn)合格。所有檢測盲法完成。
根據(jù)AChR抗體商品化ELISA和RIA試劑盒說明書提供的界值，其中一種方法判定陰性即作為AChR抗體陰性患者，使用商品化RIA試劑盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）檢測MuSK抗體，共在22例患者中檢出1例MuSK抗體陽性者。
結(jié)果：所有樣本均在各自檢測方法的檢測范圍內(nèi)獲得檢測值。提示試劑盒的檢測范圍可涵蓋絕大多數(shù)患者和陰性對(duì)照。每批次檢測陽性質(zhì)控品用Levey-Jennings質(zhì)控圖評(píng)估后均符合質(zhì)控要求。
3. 界值的優(yōu)化
3.1 去離群值
OD或cpm值超過mean±3SD者判定為離群值，在HC組和OAD組各發(fā)現(xiàn)1例離群值：HC組（OD=1.579, cpm=623.0）抗體水平較低，考慮為偶然誤差；OAD組（OD=0.985, cpm=4969.5）抗體水平較高，溯源發(fā)現(xiàn)為NMOSD患者，NMOSD與MG可能并發(fā)，但此例患者無MG臨床表現(xiàn)。最終79例HC和79例OAD納入分析。
3.2 批內(nèi)和批間差異
結(jié)果：采用陽性質(zhì)控品高、中、低三個(gè)濃度進(jìn)行批內(nèi)和批間質(zhì)控，所有原始值和轉(zhuǎn)化值的變異系數(shù)（CV）均< 12%，顯示試劑盒檢測的可重復(fù)性。
3.3 確定界值
3.3.1 正態(tài)性檢驗(yàn)和界值建立：
采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)判斷原始值或轉(zhuǎn)化值是否符合正態(tài)分布。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)集采用mean+3SD或mean-3SD計(jì)算界值；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)集采用：1）97.5%分位或2.5%分位；2）轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布數(shù)據(jù)后用轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)計(jì)算mean± 3SD再轉(zhuǎn)回作為界值。采用HC數(shù)據(jù)以及HC+OAD數(shù)據(jù)建立兩套界值。用HC+OAD數(shù)據(jù)集的最小值（OD值）或cpm值及所有轉(zhuǎn)化值的最大值形成一套界值（粗暴法）。從MG整組和HC+OAD組的OD或cpm值采用ROC獲得Youden指數(shù)最大時(shí)的界值。
結(jié)果：
用以上方法建立的界值見表2。以HC+OAD為對(duì)照組，采用粗暴法建立的界值與用mean±3SD統(tǒng)計(jì)法建立的界值接近，尤其是用原始值建立的界值。
表2 轉(zhuǎn)換方法、粗暴法和ROC法形成的界值
3.3.2 選擇界值：
以對(duì)照組的假陽性率低且MG組的陽性率下降不多為標(biāo)準(zhǔn)選擇界值。
結(jié)果：
以HC或HC+OAD作為對(duì)照，各界值的假陽性率和在MG組的真陽性率見表3。97.5%分位或2.5%分位法由于人為設(shè)定了假陽性率，獲得的界值最不理想，首先排除。以mean±3SD方法建立的界值中，以HC為對(duì)照形成界值的假陽性率顯著高于以HC+OAD為對(duì)照形成的界值。進(jìn)一步散點(diǎn)圖（圖A、C分別為OD或cpm原始值，B、D分別為轉(zhuǎn)化值）分析可見OAD個(gè)體檢測到的抗體水平總體稍高于HC個(gè)體，提示自身免疫疾病的非特異性結(jié)合，證實(shí)選擇HC+OAD作為對(duì)照建立界值的合理性。采用HC+OAD為對(duì)照，采用統(tǒng)計(jì)法mean±3SD從原始值和轉(zhuǎn)化值建立的界值在對(duì)照的假陽性率為0~1.27%，在MG患者的真陽性率為74.03~77.92%。
表3 根據(jù)各界值得到的在對(duì)照個(gè)體的假陽性率和在MG患者的真陽性率
圖A~D OD值、cpm值和濃度值的離散性
3.3.3 選擇抗體水平的表達(dá)值
根據(jù)散點(diǎn)圖可見，HC和OAD的濃度值的離散程度均高于原始值（OD和cpm），因此將HC的原始值和轉(zhuǎn)化值的CV進(jìn)行比較選擇最佳抗體水平表達(dá)值。
經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的數(shù)據(jù)，如果其變異較大，則有可能通過轉(zhuǎn)化工作曲線或公式放大其變異性。HC人群是理論上抗體水平變異最小的人群，因此進(jìn)一步在HC個(gè)體原始值的10~90%范圍內(nèi)等間隔選取數(shù)值計(jì)算轉(zhuǎn)化值進(jìn)行模擬。
結(jié)果：原始值（OD或cpm）的CV最小（表4），模擬的結(jié)果也是原始值的CV最?。ū?/span>5）。因此選擇原始值作為抗體定量檢測的表達(dá)值，并采用其相應(yīng)界值完成后續(xù)分析。
表4 HC個(gè)體的原始值和轉(zhuǎn)化值的CV
表5 模擬計(jì)算得到的CV
采用原始值分析，用粗暴法建立的界值與用mean±3SD法建立的界值得到幾乎一樣的陽性率，進(jìn)一步證實(shí)了原試劑盒采用粗暴法建立界值的合理性。但ROC法結(jié)果建立的界值雖然MG的真陽性率稍高，但對(duì)照組中的假陽性率明顯增高，因此無法作為界值（表3）。
表6 在MG整組及各亞組的診斷效能（最上一行[Ref]是整組使用試劑盒界值的結(jié)果，其他均為本研究建立的界值的結(jié)果）
5. 比較ELISA法和RIA法的檢測一致性
5.1使用散點(diǎn)圖判斷兩種方法抗體陽性者的一致性（圖E）
5.2 Spearmen秩相關(guān)判斷兩種方法抗體定量的一致性
結(jié)果：MG整組OD值和cpm值具有良好相關(guān)性（rs=-0.92, 95%CI: -0.95~-0.88, p<0.01, n=77）（圖F），用兩種方法檢測均判為AChRAb陽性者也有良好相關(guān)性（rs=-0.84, 95%CI: -0.91~-0.74, p<0.01, n=55）。
圖E 散點(diǎn)圖判斷AChRAb陽性者的一致性 圖F AChRAb定量值的相關(guān)性
5.3 定性判斷兩種方法的檢測一致性
分別用ROC曲線、Kappa檢驗(yàn)和McNemar卡方檢驗(yàn)判斷兩種方法的檢測一致性。
結(jié)果：ROC曲線顯示ELISA和RIA法檢測抗體陽性者間有良好的一致性（圖G，ELISA的AUC 95%CI: 0.89~0.97，RIA的AUC 95%CI: 0.90~0.98）。采用mean±3SD法建立的界值，陽性者在MG整組及其亞組均有中到高度的一致性，McNemar檢驗(yàn)，p均>0.05；Kappa檢驗(yàn)，加權(quán)к為 0.71~1.00，p均<0.01（表7）。采用ROC法建立的界值在MG整組的陽性者一致性較差，McNemar檢驗(yàn)，p<0.01；加權(quán)к為0.66，p<0.01。
表7 各組患者用兩種方法判斷AChRAb陽性率的一致性及組間差異
圖G ROC法比較抗體陽性的一致性 圖H和I 雙圖ROC法進(jìn)行抗體陽性者的一致性分析
5.4 兩種方法檢測不一致者的分析
觀察MG患者兩種方法檢測判斷抗體陽性的一致性，并用雙圖ROC法判斷不一致者是否落在灰區(qū)內(nèi)?；覅^(qū)指臨界值，取界值相應(yīng)的敏感性和特異性兩側(cè)的10%為臨界（圖H和I）。
結(jié)果：55名MG患者ELISA和RIA法均為陽性，18名患者兩種方法均為陰性，4名（7.3%）患者在陽性判斷不一致。兩名患者ELISA法（OD 1.59和1.60，界值≤1.79）判為陽性而RIA法（cpm 1105.50和1179.00，界值≥1234.12）判為陰性。兩名患者ELISA法（OD 1.88和2.02）判為陰性而RIA法（cpm 2211.50和2769.00）判為陽性。落在灰區(qū)中者ELISA法10例，RIA法15例。兩種方法不一致者落在灰區(qū)中的ELISA法4例，RIA法3例。
兩種檢測方法陽性者的不一致主要來自檢測灰區(qū)（即臨界值范圍）。
6. 抗體水平與MG臨床特征間的關(guān)系
6.1 各臨床特征亞組兩種方法判斷AChRAb陽性者的差異
結(jié)果：以年齡、性別、胸腺瘤、采集樣本時(shí)的肌肉受累和嚴(yán)重程度（QMGS評(píng)分）分組，結(jié)果見表7。采樣時(shí)全身型和嚴(yán)重者的陽性率顯著高于其對(duì)應(yīng)亞組。
6.2 各臨床特征亞組AChRAb水平的差異
結(jié)果：各亞組的兩種方法的定量檢測值見圖J和L。年齡大、伴胸腺瘤、采樣時(shí)全身型及嚴(yán)重者的AChRAb水平高于其對(duì)應(yīng)亞組。
圖J和圖L ELISA法和RIA法定量檢測值在不同亞組間的差異
6.3 QMGs與抗體水平的相關(guān)性
結(jié)果：在兩種方法檢測均判為陽性者（n=55），ELISA法（rs=-0.60，95%CI -0.75~-0.39， p<0.01）和RIA法（rs=0.57，95%CI 0.36~0.73，p<0.01）檢測的抗體水平與QMGs中度相關(guān)。
圖K和M AChRAb陽性者ELISA法和RIA法檢測值與QMGs的相關(guān)性
優(yōu)勢和不足
1. 優(yōu)勢：
（1）以HC+OAD為對(duì)照，采用系統(tǒng)化的方法優(yōu)化定量檢測的界值。
（2）采用主要臨床特征代表性的抽樣人群，并在MG整組及亞組驗(yàn)證界值的診斷效力。
（3）詳細(xì)分析陽性者和檢測值與臨床特征的關(guān)系。
2、不足
（1）OAD對(duì)照不是MG的常見鑒別診斷疾病。但多數(shù)鑒別診斷疾病可通過病史、神經(jīng)系統(tǒng)檢查和其他實(shí)驗(yàn)室檢查來鑒別，而本研究設(shè)置OAD對(duì)照的目的是消除自身免疫背景所致的非特異性結(jié)合。
（2）HC和OAD組的樣本量較小。但給我們分析數(shù)據(jù)正態(tài)分布與界值關(guān)系提供了良好的機(jī)會(huì)，通過轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布，我們建立的界值獲得了良好的診斷效力。
編輯：李尊波/謝琰臣；顧問：許賢豪。
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