文章來源于罕見病信息網(wǎng)，譯：田璟鸞 校:黃娟
1. 背景
視神經(jīng)脊髓炎(NMO)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫脫髓鞘疾病，主要累及視神經(jīng)和脊髓，其特征是患者血清中存在水通道蛋白4抗體。2004年，梅奧診所的研究團(tuán)隊(duì)初次在NMO患者血清中發(fā)現(xiàn)了一種特異性的、在小鼠大腦的血腦屏障處或附近結(jié)合的NMO -免疫球蛋白G(IgG)。2005年，NMO-IgG的抗原決定簇被鑒定為水通道蛋白4（AQP4），一種在血腦屏障的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突中密集表達(dá)的水通道蛋白。AQP4有兩種主要的異構(gòu)體，M1異構(gòu)體：全長323個(gè)氨基酸，翻譯起始點(diǎn)在Met-1，M23異構(gòu)體：較短的301個(gè)氨基酸，翻譯起始位點(diǎn)為Met-23。這兩種異構(gòu)體有22個(gè)n端胞質(zhì)氨基酸的差異，雖然不是AQP4抗體的靶點(diǎn)，但影響細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。兩種異構(gòu)體均可組裝成四聚體AQP4；但只有M23異構(gòu)體在細(xì)胞膜上以規(guī)則的方形排列，稱為正交四聚體(OAP)。2006年，血清中水通道蛋白4抗體的陽性檢測結(jié)果已納入修訂的NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的水通道蛋白4抗體檢測方法對于診斷和治療這種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要的臨床意義。自從發(fā)現(xiàn)抗AQP4抗體以來，已經(jīng)提出了幾種檢測方法，包括對小鼠、大鼠或靈長類組織的各種冷凍切片進(jìn)行間接免疫熒光法(IIF)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)人AQP4的IIF，通過熒光顯微鏡來直觀定量（CBA）或通過流式細(xì)胞術(shù)（FACS）；以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫沉淀法(RIPA)和熒光免疫沉淀法(FIPA)檢測部分純化的AQP4。然而，這些方法的診斷準(zhǔn)確性(如靈敏度和特異性)差異很大。許多技術(shù)方面的因素可能會影響測定準(zhǔn)確性，包括所使用的切片的類型和種類，轉(zhuǎn)染和固定方法，AQP4的物種和異構(gòu)體。目前，CBA平均診斷準(zhǔn)確率為76.5%，明顯高于其他方法(48.5-62.3%)。然而，CBA僅提供半定量結(jié)果，結(jié)果判讀依賴于觀察者，尤其是測定血清抗體滴度時(shí)存在勞動強(qiáng)度大，耗時(shí)長的缺陷。基于蛋白質(zhì)的檢測方法，如ELISA法，可能解決上述這些技術(shù)問題：易于使用，可大樣本量分析，并可實(shí)現(xiàn)自動化檢測。Hayakawa等（2008）第一次以重組大鼠AQP4為包被抗原，采用ELISA法直接檢測血清AQP4抗體。而Kim等（2012）以人的AQP4作為包被抗原的ELISA法獲得相似靈敏度，但特異性更高。此后不久，RSR有限公司(Cardiff, UK) 使用M1-AQP4異構(gòu)體研制出第一款商用ELISA試劑盒，但據(jù)Isobe（48.3%），F(xiàn)ryer（58%）和Jarius(78.5%)等報(bào)道的該款ELISA檢測靈敏度，還不能作為一個(gè)有效的CBA替代方案。最近，RSR有限公司開發(fā)了一種新版的基于人類重組AQP4 M23異構(gòu)體的ELISA檢測方法。本研究旨在評價(jià)這種新型M23-ELISA產(chǎn)品在全自動檢測系統(tǒng)上的分析和臨床準(zhǔn)確性。
2. 材料與方法
2.1 病例
從4個(gè)意大利境內(nèi)中心收集了64例NMOSD患者(24例NMO, 24例LETM, 13例單獨(dú)ON, 3例脊髓炎) 和27例對照組(17例多發(fā)性硬化(MS)和10例健康受試者(HS))的血清樣本。所有NMO患者都符合Wingerchuk 2006年的標(biāo)準(zhǔn)。所有LETM患者均被臨床確診為至少三節(jié)的脊髓病變。多發(fā)性硬化癥的診斷依據(jù)McDonald標(biāo)準(zhǔn)。同樣的血清樣本曾使用間接免疫熒光法（IIF）產(chǎn)品(“Neurology Mosaic 17", Euroimmun, Luebeck, Germany)檢測NMO-IgG。
表1 患者和對照組的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床和血清學(xué)特征
2.2 方法
AQP4抗體檢測采用RSR AQP4Ab ELISA 新產(chǎn)品, 包被的人重組AQP4 M23異構(gòu)體（RSR Ltd），在全自動ELISA操作系統(tǒng)（SkyLAB 752 DASITGroup, Cornaredo, Italy）完成。
2.3分析評估
· 精密度研究
使用RSR ELISA產(chǎn)品中兩種商用陽性對照血清(AQP4 Ab C-1，12.1 U/mL和C-2，28 U /mL)，在不同日內(nèi)進(jìn)行了5次獨(dú)立的試驗(yàn)，每次均進(jìn)行3次重復(fù)的檢測，以驗(yàn)證批內(nèi)、不同日間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精準(zhǔn)度。符合臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)的EP15-A3指南。
· 統(tǒng)計(jì)分析
使用ANOVA方差分析評估批內(nèi)、不同日間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度。使用受試者工作特征曲線（ROC曲線）確定AQP4抗體檢測合適的臨界值。使用NMOSD組患者的AQP4抗體檢測結(jié)果進(jìn)行靈敏度分析，用對照組檢測結(jié)果進(jìn)行特異性分析。采用似然比 (LR)評價(jià)ELISA的臨床應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)常規(guī)，LR (陽性似然比)陽性>10或LR (陰性似然比)陰性< 0.1的檢測被認(rèn)為是臨床有用的。Kruskal-Wallis檢驗(yàn)用于評估患者組和對照組之間的AQPR抗體水平差異，Mann-Whitney unpaired U檢驗(yàn)用于比較不同組的抗體中位數(shù)水平。用Fisher’s exact檢驗(yàn)評估NMO和LETM患者AQP4抗體占比的差異。P值＜0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。使用MedCalc軟件（Marialerke, Belgium）進(jìn)行ROC曲線分析，使用GraphPad Prism Version 5和Analyse-it Version 4.10.2.進(jìn)行所有的統(tǒng)計(jì)分析。
3. 結(jié)果
3.1精密度測試
C-1的平均濃度為12.41 U/mL，批內(nèi)CV%為3.2%，不同日間CV%為7.6%，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV%為8.2%。C-2平均濃度為28.12 U/mL，批內(nèi)CV%為3.0%，不同日間CV%為7.4%，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV%為8.0%?？傊貜?fù)性，以標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示(實(shí)驗(yàn)室內(nèi))，C-1結(jié)果為1.02，C-2結(jié)果為2.25，分別接近制造商所聲明的基于重復(fù)性獲得的驗(yàn)證值1.96和4.20（SD C-1=1.30 和SD C-2=2.77），精密度測試的數(shù)據(jù)見表2。
表2 根據(jù)CLSI EP15-A評價(jià)AQP4抗體ELISA檢測的精密度
3.2 AQP4抗體檢測
ELISA可實(shí)現(xiàn)對AQP4抗體水平的定量檢測。在NMOSD患者中，抗體濃度范圍在1.5 U/mL和464 U/mL間。抗體濃度中位數(shù)為NMO患者27.9 U/mL (1.5-464 U/mL)，LETM患者1.5 U/mL (1.5-214.5 U/mL)，ON和脊髓炎患者分別為1.5 U/mL (1.5-1.9 U/mL) 和1.5 U/mL (1.5-3.1 U/mL)。對照組的平均濃度為1.5 U/mL (1.5-2.1 U/mL)。NMO組血清中抗AQP4抗體濃度中位數(shù)高于其他NMOSD組和對照組(Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，p < 0.0001)。尤其是，NMO患者抗AQP4抗體濃度中位數(shù)高于LETM和ON患者（圖1）。
圖1 NMO患者，LETM患者，ON患者，脫髓鞘患者及對照組（包括：多發(fā)性硬化（MS）和健康研究對象（HS））中AQP4自身抗體水平的分布，以Unit/mL表示。Kruskal Wallis test, p < 0.0001; NMO患者的AQP4抗體水平中位數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上高于LETM和ON患者的抗體水平 (Mann–Whitney Unpaired U-test, p = 0.0006 and p < 0.0001, respectively)
由ROC曲線確定臨界值為2.1U/mL，ELISA檢測AQP4抗體在NMO患者的靈敏度為83.3% (95% CI 62.6% ~ 95.2%)，特異性為100% (95% CI 87.1%-100%)，以及非常高的陽性似然比(∞) 和陰性似然比(0.17)(表 3)。NMO患者的計(jì)算出的曲線下面積(AUC)的值為0.895 (95% CI 0.777-0.963) (圖2)。
圖2 a NMO患者AQP4自身抗體的(ROC)曲線分析。曲線下面積(AUC)是0.895。B LETM患者AQP4自身抗體檢測的ROC曲線分析。AUC是0.625。連續(xù)線為ELISA法；虛線表示95%的置信區(qū)間
表3 NMO和LETM患者的診斷靈敏度、特異性和似然比(陽性似然比、陰性似然比)
在相同的臨界值下，LETM患者的靈敏度和特異性分別為25% (95% CI 9.8%-46.7%)和100% (95% CI 87.1%-100%)，陽性似然比是∞，陰性似然比是0.75（表3）。
NMO患者與LETM患者AQP4抗體比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為83.3%和25%)( Fisher exact檢驗(yàn)，p = 0.0001)。
13例ON患者組均為AQP4抗體陰性，3例脊髓炎患者組除1例外其他2例為AQP4抗體陰性。所有對照均為AQP4抗體陰性。
間接免疫熒光法（IIF）與ELISA方法的結(jié)果*一致 (Cohen’s Kappa = 1.00)。
4. 討論
AQP4抗體是輔助診斷NMO患者的一個(gè)重要的工具，并已被納入該疾病的修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)。最近，AQP4抗體也在單一橫貫脊髓炎患者、單一視神經(jīng)炎患者以及患有NMOSD并同時(shí)存在結(jié)締組織疾病的患者中被發(fā)現(xiàn)。因此，國際NMO診斷小組(IPND) 根據(jù)患者血清中AQP4抗體的存在，引入了新的命名法和新的診斷標(biāo)準(zhǔn)。新命名將所有與NMO相關(guān)的疾病統(tǒng)一為NMOSD，進(jìn)一步分為AQP4抗體陽性的NMOSD、AQP4抗體陰性的NMOSD和AQP4抗體狀態(tài)不明的NMOSD。這些新標(biāo)準(zhǔn)使需要檢測水通道蛋白4抗體的臨床病例數(shù)量增加。
檢測AQP4抗體的重要性不僅因?yàn)镹MO與MS盡早和準(zhǔn)確的鑒別診斷，并且還因?yàn)閮烧咧委煵呗缘牟町?。諸如β-干擾素和醋酸格拉替雷(Copaxone)的免疫調(diào)節(jié)藥物被認(rèn)為是多發(fā)性硬化癥的第一選擇，免疫抑制藥物特別是B細(xì)胞靶向治療被認(rèn)為是治療NMO的有利因素。
多種AQP4抗體的檢測方法已經(jīng)被研發(fā)。其中基于AQP4-M1異構(gòu)體的血清學(xué)檢測是首先被使用的方法。直到近些年，隨著OAPs被證明為是NMO-IgG主要的靶點(diǎn)，AQP4-M23才被越來越廣泛地用作靶點(diǎn)抗原。
Kim等使用內(nèi)部ELISA，同時(shí)檢測了兩種異構(gòu)體，在確診或高危NMO患者的檢出率方面，沒有發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體之間的任何差異，他們選擇使用M23異構(gòu)體，因?yàn)樗岣吡诵旁氡?。同樣的，Waters等通過商用CBA，在比較人類M1或M23異構(gòu)體時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)靈敏度的差異，但使用M23的信號增加。Mader使用活的人胚胎腎(HEK)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)M23異構(gòu)體的靈敏度更高。這些作者還觀察到兩種方法中不同的染色模式。與M23異構(gòu)體相比，與M1異構(gòu)體結(jié)合的抗體顯示出更小的染色斑點(diǎn)，這支持了之前的數(shù)據(jù)，M23異構(gòu)體在HEK細(xì)胞中形成OAP。
此外，使用NMO患者的血清和重組AQP4特異性單克隆抗體，Crane等發(fā)現(xiàn)，由于OAP結(jié)構(gòu)的原因，M23比M1在AQP4-IgG單克隆抗體或其Fab片段上顯示出具有持續(xù)的更高的親和力，這再次表明AQP4異構(gòu)體的選擇以及OAP的結(jié)構(gòu)可以直接影響檢測靈敏度。
本研究的目的是評價(jià)一種新的商用M23抗原ELISA檢測AQP4抗體的性能。結(jié)果與間接免疫熒光法商用IIF產(chǎn)品的結(jié)果進(jìn)行比較。雖然沒有直接與使用M1-AQP4的ELISA進(jìn)行比較，但我們的數(shù)據(jù)顯示，靈敏度(83.3%) 高于之前使用M1異構(gòu)體的研究報(bào)告，與CBA獲得的平均靈敏度相似(76.7%；范圍55.6-96.7%)，顯著高于其他方法(范圍48.5-62.3%)。
最后，ELISA檢測結(jié)果與目前檢測AQP4抗體的參考方法（間接免疫熒光法IIF）檢測結(jié)果一致(100%一致)。
我們的研究也旨在評價(jià)這種新的AQP4 抗體ELISA分析方法的準(zhǔn)確性。它的重要性在于，因?yàn)橐恍┓椒ㄔ诓煌膶?shí)驗(yàn)室應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生了不一致的結(jié)果，同一樣品在不同的檢測方法中檢測出不一致的結(jié)果。然而，結(jié)果可重復(fù)的AQP4抗體檢測對于大型多中心研究來說至關(guān)重要，這些研究旨在更好地確定NMO患者的流行病學(xué)、臨床和病理特征以及他們對治療的反應(yīng)。
我們發(fā)現(xiàn)，使用兩種不同抗體濃度檢測批內(nèi)、不同日間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以CV表示的精密度變異系數(shù)低，在對低濃度和高濃度AQP4抗體的陽性對照上測量的總重復(fù)性甚至比相同濃度水平下制造商所聲稱的更好。
該檢測具有良好的分析精密度和準(zhǔn)確度，以及在全自動系統(tǒng)上體現(xiàn)的相對易用和快速響應(yīng)的的特性，證明該檢測對于適用于日常檢測，并可能適合用于AQP4抗體的長期監(jiān)測。
本研究的進(jìn)步意義體現(xiàn)在兩個(gè)重要方面。一方面是可以使各家實(shí)驗(yàn)室獲得簡單易用的AQP4抗體定量方法，另一方面是這款新的ELISA方法在特異性與靈敏度上的良好表現(xiàn)，其性能與當(dāng)下的金標(biāo)準(zhǔn)CBA方法一致。
本研究初次評價(jià)了一種新型的商用ELISA檢測AQP4抗體的方法，是一種有效的CBA替代方法。我們相信，我們的發(fā)現(xiàn)可以為輔助AQP4抗體檢測奠定基礎(chǔ)，從而促進(jìn)對NMOSD病人更早、更準(zhǔn)確的診斷。
參考文獻(xiàn)：Tampoia M , Abbracciavento L , Barberio G , et al. A new M23-based ELISA assay for anti-aquaporin 4 autoantibodies: diagnostic accuracy and clinical correlation[J]. Auto-Immunity Highlights, 2019, 10(1).
原文標(biāo)題：
A new M23-based ELISA assay for anti-aquaporin 4 autoantibodies: diagnostic accuracy and clinical correlation
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