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標(biāo)題： 在自動(dòng)化系統(tǒng)上(SkyLAB 752) 用ELISA 方法檢測乙酰膽堿受體抗體：根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (CLSI) EP15-A 評估其分析性能  

作者：Letizia Abbracciavento1, Ruggiero Fumarulo1, Marilina Tampoia1  

摘要：

背景： 乙酰膽堿受體抗體 (AChRAb) 目前在臨床實(shí)驗(yàn)室中主要通過放射免疫測定法來檢測，該法利用從人體肌肉中提取的受體并通過¹²⁵I-α-金環(huán)蛇毒素標(biāo)記進(jìn)行檢測和定量。Hewer 等人（2006）基于純化的胎兒和成人乙酰膽堿受體的用途，開發(fā)了一種新的酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA)。根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (CLSI) 的建議，本研究的目的為驗(yàn)證 ELISA 測試并制定其在自動(dòng)儀器上的實(shí)施方案。  

方法： 為了得到批內(nèi)，不同檢測日間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的精密度，我們使用RSR Ltd廠家診斷試劑盒中的兩種 AChRAb 對照品，一種高值陽性對照品 (C1) 和一種低值陽性對照品 (C2)，在不同日內(nèi)進(jìn)行了5次獨(dú)立的試驗(yàn)，每次均進(jìn)行3次重復(fù)檢測。診斷試劑盒中包含四種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（E1，0.5 nmol/L；E2，1.0 nmol/L；E3，6.5 nmol/L；E4，20 nmol/L），為驗(yàn)證正確度，進(jìn)行連續(xù)五天重復(fù)測試。

結(jié)果：在精密度測試過程中，高值對照品的檢測平均濃度為 11.2 nmol/L（對照 C1），其批內(nèi)CV值為7.9%（95% CI，0.61~1.52），不同檢測日間CV值為 8.4%（95% CI，0.00~2.98），實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV值為11.5%（95%CI，0.92~3.12）。低值對照品的檢測平均濃度為3.2 nmol/L（對照 C2），批內(nèi)CV值為5.6%（95% CI，0.13~0.32），不同檢測日間CV值為1.9%（95% CI，0.00~0.33）， 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV值為6.0% （95% CI，0.15 ~ 0.39）。以標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD) 表示（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)）的總重復(fù)性，C1 為 1.27，C2 為 0.19，更優(yōu)于廠家聲明的重復(fù)性獲得的驗(yàn)證值（分別為 1.37 和 0.49）[ SD (C1) = 0.95874 和 SD (C2) = 0.3589]。

結(jié)論： 在真實(shí)世界中獲得的分析性能證實(shí)了在實(shí)驗(yàn)階段產(chǎn)生的產(chǎn)品規(guī)范參數(shù)，并表明即使使用自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行分析，測試的可靠性仍然保證。測試的良好精密度和準(zhǔn)確度及其在易用性和快速響應(yīng)的自動(dòng)化系統(tǒng)上的可用性使我們得出結(jié)論，該測試對于常規(guī)使用是令人滿意的，并且可適用于 AChRAb 的長期監(jiān)測。  

關(guān)鍵詞：乙酰膽堿受體抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)，驗(yàn)證  

正文：

簡介: 重癥肌無力(MG)是一種以神經(jīng)肌肉傳遞障礙為特征的自身免疫性疾病，乙酰膽堿受體自身抗體(AChRAb) 的檢測是診斷重癥肌無力 (MG) 一種非常有效且廣受認(rèn)可的方法。

AChRAb可以與成人和胎兒AChR的不同亞基發(fā)生反應(yīng)；然而，大多數(shù) (50%)是與α亞基胞外區(qū)特定的免疫顯性區(qū)域結(jié)合[1]。

目前，這些自身抗體的常規(guī)檢測主要基于用¹²⁵I-α-BuTx 標(biāo)記的人類 AChR，¹²⁵I-α-BuTx是一種與AChR親和度高的蛇毒素。

盡管放射免疫法檢測AChRAb被廣泛應(yīng)用，但使用放射性化合物有技術(shù)和環(huán)境上的限制。因此，使用不同技術(shù)和不同的抗原制備的檢測法作為放射免疫法的替代方法被提出。  

2006年，Hewer 等在使用純化的胎兒和成人AChR的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種新的酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA) [2]。

這種 ELISA 方法顯示出良好的靈敏度(92%) 和出色的特異性(99%)。此外，比較ELISA法和RIA法，顯示兩種檢測法之間有很好的一致性（r = 0.85，n = 83，P<0.001）

為了確保滿足建立專業(yè)認(rèn)可的自身免疫實(shí)驗(yàn)室所需的要求，我們根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (CLSI) 的建議，驗(yàn)證了 ELISA 測試并制定了在自動(dòng)儀器上的實(shí)施方案 [3]。

此外，一旦實(shí)施并成為用戶的例行程序后，該方法可以通過經(jīng)認(rèn)可的外部質(zhì)量評估計(jì)劃(UK NEQAS)的參與進(jìn)行監(jiān)控。  

材料與方法  

AChRAb ELISA 

Anti-AChRAb ELISA（RSR Ltd，Cardiff，UK）基于競爭抑制法。

自動(dòng) ELISA 操作系統(tǒng)  

根據(jù)廠家的建議，我們實(shí)驗(yàn)室使用Sky-LAB 752自動(dòng)ELISA操作系統(tǒng)（DASITGroup，Cornaredo，Italy）進(jìn)行AChRAb 測試。

方法驗(yàn)證  

精密度和真值是驗(yàn)證測試所需的性能參數(shù)，根據(jù) CLSI 指南 EP15-A [3] 中的描述進(jìn)行評估。為了得到批內(nèi)，不同檢測日間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的精密度，我們使用RSR Ltd廠商試劑盒中的兩種商業(yè) AChRAb 對照品，一種高值陽性 (C1, 7.5 nmol/L) 和一種低值陽性 (C2, 1.6 nmol/L)，在不同日內(nèi)進(jìn)行了5次獨(dú)立的試驗(yàn)，每次均進(jìn)行3次重復(fù)檢測。為研究正確度，對診斷試劑盒中包含的四種不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品（E1，0.5 nmol/L；E2，1.0 nmol/L；E3，6.5 nmol/L；E4，20 nmol/L）進(jìn)行連續(xù)五天復(fù)孔檢測。

外部質(zhì)量評估

一旦實(shí)施并且該方法成為用戶的常規(guī)方法，我們于2016年4月至2017年10月參與了英國 NEQAS 質(zhì)量控制以評估AChRAb的檢測。

統(tǒng)計(jì)分析

ANOVA測試用于計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù) (CV)% 和實(shí)驗(yàn)室內(nèi) CV%。 使用Analyze it軟件版本4.21進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果  

精密度分析

表 1 和表 2 顯示了 5 天內(nèi)獲得的測定值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD) 和方差。

精密度實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)陽性對照樣品（C1 和 C2）的結(jié)果見表 3。

總重復(fù)性以 SD（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)）表示，結(jié)果 C1 為 1.27，C2 為 0.19，低于根據(jù)制造商聲明的重復(fù)性驗(yàn)證值（分別為 1.37 和 0.49），以SD表達(dá) [C1 的 SD = 0.95874 和 C2 的 SD = 0.3589]。

表1  AChRAb 高濃度陽性對照品 (C1, 7.5 nmol/L)5天的檢測值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和方差  表2  AChRAb 低濃度陽性對照品 (C2, 1.6 nmol/L)5天的檢測值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和方差   表3  根據(jù) CLSI EP 15-A 使用廠商提供的 2 個(gè)陽性對照品（C1 和 C2）進(jìn)行的精密度實(shí)驗(yàn) 表4 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) CLSI EP15-A 使用廠商提供的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行正確度實(shí)驗(yàn)

正確度研究

使用四種標(biāo)準(zhǔn)品檢測分析正確度顯示測定值的平均值與真實(shí)值之間具有良好的相關(guān)性。差異（系統(tǒng)誤差）是可以接受的，正如 P 值所證明的那樣，這些 P 值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表 4 和圖 1）。

圖 1 分析方法的不精確估計(jì)（系統(tǒng)誤差）

AChRAb 的室間質(zhì)量評價(jià) 

對 UK NEQAS 報(bào)告提供的數(shù)據(jù)分析表明，我們的結(jié)果在定性數(shù)據(jù)（陽性/陰性）方面與所有其他 110 個(gè)參與實(shí)驗(yàn)室（Cohen's k = 1.000）一致。關(guān)于定量數(shù)據(jù)，我們的結(jié)果與使用我們 ELISA 方法的實(shí)驗(yàn)室的平均值沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Mann-Whitney 檢驗(yàn) p = 0.06）。然而，我們注意到 ELISA 結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于使用 RIA 方法獲得的結(jié)果（Mann-Whitney 檢驗(yàn) p = 0.0004）。

討論

AChRAb的測定是MG診斷和臨床隨訪的基本實(shí)驗(yàn)室支持[4, 5]。即使AChRAb 滴度不總是與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，但單個(gè)患者的連續(xù)測定結(jié)果可能顯示出與MG癥狀的很好相關(guān)性 [6]。

盡管過去推薦的AChRAb 診斷方法是 RIA法，但ELISA方法已經(jīng)被認(rèn)為是一種合適的技術(shù) [7]。事實(shí)上，英國 NEQAS 報(bào)告提供的數(shù)據(jù)顯示，大約一半的參與實(shí)驗(yàn)室使用市售的ELISA方法。將ELISA法測定結(jié)果與常規(guī) RIA 方法進(jìn)行比較，來評估其分析性能，發(fā)現(xiàn) RIA 和 ELISA 之間具有很好的一致性 [2]。

根據(jù)自身免疫實(shí)驗(yàn)室應(yīng)遵守的技術(shù)要求[8]，我們驗(yàn)證并證實(shí)了市售AChRAb ELISA在自動(dòng)化測試時(shí)的分析準(zhǔn)確性。

使用 SKYLab 752 儀器，我們發(fā)現(xiàn)以批內(nèi)精密度、不同檢測日間精密度和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度表示的分析誤差介于 1.9% 至 11.5% 之間，與其他自身抗體測定相比，該水平的誤差*可接受 [9]。在低水平和高水平AChRAb 陽性對照品上測得的總體重復(fù)性，更優(yōu)于制造商聲明的性能指標(biāo)[3]。

因此，在真實(shí)世界中獲得的分析性能確認(rèn)了在實(shí)驗(yàn)階段中形成的產(chǎn)品規(guī)格參數(shù)，并表明即使在自動(dòng)化系統(tǒng)中進(jìn)行分析時(shí)，測試的可靠性仍然保證。

總體而言，該測試的良好精密度和準(zhǔn)確度及其在易用性和快速響應(yīng)性的自動(dòng)化系統(tǒng)上的可用性，使我們得出結(jié)論：該測試對于常規(guī)使用上是令人滿意的，并且可能適用于長期監(jiān)測AChRAb。

為了確保自身免疫實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系的要求，我們參加了一次有組織的實(shí)驗(yàn)室間比較，我們的結(jié)果與參與室間質(zhì)量評價(jià)的其他實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果非常吻合 [8]。

因此，我們獲得的定性結(jié)果與使用相同 ELISA 方法測定AChRAb 的其他實(shí)驗(yàn)室提供的平均數(shù)據(jù)一致。相反，使用RIA方法的實(shí)驗(yàn)室提供的定量數(shù)據(jù)低于ELISA方法提供的數(shù)據(jù)。

這種差異的可能解釋可以用標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA 曲線動(dòng)態(tài)范圍來表示?？贵w濃度測定中的這種差異阻礙了用兩種方法獲得的結(jié)果之間的定量比較。

在建立自身抗體檢測的參考標(biāo)準(zhǔn)上，幾項(xiàng)行動(dòng)已實(shí)施。例如疾病預(yù)防控制中心（CDC）近期批準(zhǔn)了一種用于抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測的參考物質(zhì)[10]。乙酰膽堿受體抗體同樣需要參考物質(zhì)，為了能夠以國際單位IU對乙酰膽堿受體抗體的檢測數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)定量表示，并協(xié)調(diào)和標(biāo)準(zhǔn)化這種自身抗體的測定。

｜原文來自｜

作者：Abbracciavento L ,  Fumarulo R ,  Tampoia M .

題目：Anti-AChR antibodies detected by ELISA method using an automated system (SkyLAB 752): evaluation of the analytical performance according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP15-A[J].

期刊：Italian Journal of Laboratory Medicine

發(fā)表時(shí)間：2018.1.3

作者單位：Autoimmunology Section, Universitary Clinical Pathology Unit, Polyclinic of Bari, Department of Biomedical Sciences and Human Oncology, University of Bari Medical School, Bari, Italy

譯：RSRTJ